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自动化高通量提取脱落细胞检材DNA

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摘要：

脱落细胞是目前法医DNA检验中的重要检材之一，此类物证具有体积小、较为隐蔽、不易察觉、不易毁灭等特点。通过提取脱落细胞中的DNA，可以直接获取犯罪现场人员信息，为案件侦破提供重要技术支持。但在现场检材中通常仅能采集到微量的脱落细胞，且常常带有扩增抑制物，手工进行DNA提取操作复杂，提取效果因人而异，给DNA检验带来了诸多困难。为有效提高脱落细胞的获取量，必然要增加现场采样的数量，这又大大增加了后续DNA提取的工作强度。目前，建立自动化、高通量的提取脱落细胞检材DNA的有效方法已经成为法医DNA检验的重要研究方向。本研究以KingFisherTMFlex微量生物物证DNA自动化提取纯化系统（高通量版，以下简称KingFisher Flex系统）为基础，建立自动化高通量提取脱落细胞检材DNA的方法。 1 材料与方法 1.1 样本收集实际检案中的脱落细胞检材274份，包括口腔黏膜上皮脱落细胞检材60份，其中矿泉水瓶口33份、牙刷12份、食物咬痕8份、筷子牙签等餐具7份；皮肤上皮脱落细胞检材214份，其中电线插座插头、栏杆、工具握柄及把手165份，手套32份，衣帽17份。 1.2 主要仪器与试剂 9700型PCR扩增仪、3500型基因分析仪、3130xl型遗传分析仪（美国AB公司），KingFisher Flex系统（美国Thermo Fisher Scientific公司），脱落细胞粘取器（东莞市公安局研发）；案件专用磁珠法DNA提取试剂盒（长春市博坤生物科技有限公司），Identifiler? Plus试剂盒（美国AB公司）。 1.3 脱落细胞DNA的提取口腔黏膜上皮脱落细胞采用公安部物证鉴定中心研制的生物物证棉签[1]提取，皮肤上皮脱落细胞采用脱落细胞粘取器[2]提取，在脱落细胞可能存在的部位反复粘取和擦拭（至少20次）。然后将剪下的棉签头或膜片放入1mL离心管中，加入400μL消化液（液面高度要超过棉签或膜片）和10 μL蛋白酶K（质量浓度20 mg/mL），56℃条件下消化1 h，以离心半径5 cm，10 000 r/min，离心3 min，取上清液按照案件专用磁珠法DNA提取试剂盒说明书和KingFisher Flex系统预设程序进行DNA提取（按仪器处理通量分3批次进行提取）。DNA洗脱体积为40μL。 1.4 PCR扩增及荧光检验用Identifier?Plus试剂盒进行PCR扩增，反应总体积为12.5 μL，含DNA模板5 μL、反应混合液5μL、引物2.5μL。反应在9700型PCR扩增仪上进行，95℃11 min；94℃20 s，59℃60 s，72℃60 s，34个循环；60℃10min[3]。用3130xl型遗传分析仪对扩增产物进行毛细管电泳分离，用GeneMapper ID 3.2软件进行数据分析及等位基因分型。 2 结果从表1可以看出，本研究建立的自动化高通量处理方法得到的DNA检验总成功率约为50%。从提取时间来说，同时对90个裂解好的样品进行DNA提取，KingFisher Flex系统只需要50min。表1 利用KingFisher Flex系统提取DNA检验结果（份）处理批次同时处理检材数检出试剂盒全部STR基因座检材数无比对价值或无结果检材数检验成功率/% 1 .3 2 .6 3 .5 3 讨论 KingFisher Flex微量生物物证DNA自动化提取纯化系统，在同一批次内可同时进行96个样品的纯化，除去阴阳性对照样品外，每次可完成92个样品的DNA提取纯化。应用KingFisher Flex系统结合ML案件专用磁珠法DNA提取试剂盒，对脱落细胞检材进行自动化高通量提取纯化方法的适用面非常广，本研究收集的检材种类包括纺织物、金属表面、木器表面等，基本涵盖了大部分的现场检材。本研究建立的方法是以KingFisher Flex系统为基础，优化了脱落细胞检材的采集、处理和DNA提取等各个环节的技术操作。主要表现在：（1）在采集环节，对皮肤上皮脱落细胞广泛应用脱落细胞粘取器进行采集，与传统的棉签提取方式相比，操作直观简单，基层技术人员运用难度低，独立的包装盒防污染、防霉效果好，细胞转移效率较高且稳定[2]；（2）为消除在细胞粘取过程中夹带的杂质对扩增的抑制，本研究选择了新型的案件专用磁珠法DNA提取试剂盒，该试剂盒提取灵敏度能够达到30pg，适合微量、污染和降解检材提取纯化使用；（3）KingFisher Flex系统使用的是磁珠转移的提取方式，与液体转移提取方式相比，提取效率和纯化效率有明显优势，与手工提取基本一致。本研究结果表明，通过以上优化方法，结合自动化高通量提取仪器建立的自动化批量处理脱落细胞检材的方法非常有效地解决了各种检材脱落细胞提取的难题，为DNA分析技术在刑事案件侦破中发挥重大作用提供了强有力的支持。本方法中KingFisher Flex系统所需的提取时间比手工操作提取缩短数十倍，并且适用检材范围广，在保证提取质量的前提下，降低了操作人员的工作强度和难度，缩短了工作时间，减少了人工操作的失误，极大地提升了工作效率。